Please use this identifier to cite or link to this item:
https://rsuir-library.rsu.ac.th/handle/123456789/2300| Title: | รายงานวิจัยฉบับสมบูรณ์ โครงการวิจัย การโคลนและผลิตชิ้นโปรตีนแฟลจิลินจากเชื้อ B. pseudomallei เพื่อหาความจำเพาะต่อ melioidosis antibody |
| Other Titles: | Cloning and expression of B. pseudomallei’s flagellin antigen targeting of melioidosis antibody |
| Authors: | สุเมธ วจนรจนา |
| Keywords: | โรคเมลิออยโดสิส -- วิจัย;เมลิออยโดสิส -- การป้องกันและควบคุม |
| Issue Date: | 2554 |
| Publisher: | สถาบันวิจัย มหาวิทยาลัยรังสิต |
| Abstract: | Burkholderia pseudomallei เป็นสาเหตุของโรคเมลิออยโดสิส มีแหล่งระบาดในแถบเอเชียตะวันออกเฉียงใต้และทางตอนเหนือของออสเตรเลีย การศึกษาวิจัยครั้งนี้ต้องการผลิตชิ้นโปรตีนแฟลคจิลินของเชื้อ B. pseudomallei และทำโปรตีนที่แสดงออกให้บริสุทธิ์ เพื่อนำโปรตีนแฟลคจิลินที่ผลิตได้มาใช้เป็นเอนติเจนสำหรับพัฒนาวิธีการตรวจวินิจฉัยโรคเมลิออยโดสิสให้มีความไวและมีความจำเพาะมากขึ้น ขั้นตอนการศึกษาเริ่มจากการเพิ่มขยายยีนแฟลคจิลินโดยใช้ primers จำเพาะ(FBpI และ FBpT) ด้วยเทคนิค PCR หลังจากนั้นสร้างพลาสมิดลูกผสม (pET17b-BpFL) ซึ่งจะถูกใส่เข้าไปใน E. coli สายพันธุ์ BL21(DE3) และวิเคราะห์ผลด้วยการทำ PCR, restriction analysis และการทำ DNA sequencing เมื่อได้ transformant ที่ต้องการแล้วนำไปเหนี่ยวนำด้วย 1 mM IPTG เพื่อทำให้เกิดการสังเคราะห์โปรตีนแฟลคจิลิน นำโปรตีนที่สังเคราะห์ขึ้นไปวิเคราะห์ด้วย 12% SDS-PAGE โดยพบว่าโปรตีนที่แสดงออกมีขนาดประมาณ 40 kDa และอยู่ในรูปของ inclusion body จากนั้นทำชิ้นส่วนของโปรตีนแฟลคจิลินที่ผลิตได้ให้บริสุทธิ์ด้วย Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) และตรวจสอบด้วยเทคนิค western blot hybridization จากนั้นวิเคราะห์ปริมาณโปรตีนโดยวิธี Bradford protein assay พบว่ามีปริมาณโปรตีนเท่ากับ 0.77 mg/ml ขั้นตอนสุดท้ายจะใช้โปรตีนแฟลคจิลินที่บริสุทธิ์มาทดสอบกับซีรั่มที่ให้ผลบวกกับ indirect hemagglutination assay (IHA) จำนวน 20 ตัวอย่างเปรียบเทียบกับซีรั่มของคนปกติจำนวน 20 ตัวอย่างด้วยเทคนิค indirect enzyme linked immunosorbent assay (indirect ELISA) แล้ววิเคราะห์ข้อมูลโดยเทียบกับค่า cut off ที่ 0.2272 ที่ titer 6,400 พบว่าซีรั่มที่ให้ผลบวกกับ IHA ทั้งหมดจะให้ผลบวกด้วยวิธี indirect ELISA ด้วย ในขณะที่ซีรั่มของคนปกติให้ผลลบด้วยวิธี indirect ELISA จำนวน 16 ตัวอย่าง คิดเป็นเปอร์เซนต์ sensitivity และ specificity เท่ากับ 100% และ 80% ตามลำดับ แต่เมื่อมีการเพิ่มค่า cut off เป็น 0.2492จะได้ค่า sensitivity และ specificity เท่ากับ 90% จากผลการศึกษาชี้ให้เห็นถึงความเป็นไปได้ที่จะมีการนำโปรตีนแฟลคจิลินที่ผลิตไปใช้พัฒนาชุดตรวจโรคเมลิออยโดสิสจากซีรั่มได้ |
| metadata.dc.description.other-abstract: | Melioidosis, a disease caused by Burkholderia pseudomallei is endemic in Southeast Asian and Northern Australia. The aim of this study are to produce and purify recombinant flagellin protein of B. pseudomallei for using this protein fragment as an antigen for developing efficient method of melioidosis diagnosis. First, the flagellin gene of B. pseudomallei was amplified with specific primers (FBpI and FBpT) and then the PCR product was ligated with pET17b vector at NdeI and EcoRI sites to construct a recombinant plasmid (pET17b-BpFL). The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21(DE3) and analyzed by PCR technique, restriction analysis and DNA sequencing. The selected transformant was induced with 1 mM IPTG to express recombinant flagellin protein. The expressed protein was analyzed on 12% SDS-PAGE which it of apparent molecular weight was about 40 kDa and mostly inclusion body. Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) was carried out to purify the expressed protein and then purified protein was examined by western blot hybridization. The purified protein (∼ 0.77 mg/ml) was used as an antigen to detect for the specific binding with human sera containing melioidosis antibody by indirect ELISA. In this study, 20 positive sera with indirect hemagglutination assay (IHA) and 20 normal sera were tested. Indirect enzyme linked immunosorbent assay (indirect ELISA) data were analyzed using cut off level at 0.2272 and cut off dilution at 1:6,400. The results showed that all of positive sera showed optical density above cut off (100% sensitivity), meanwhile, only 4 samples of normal serum have positive (80% specificity). However, the sensitivity and specificity were 90% at the increasing cut off level (0.2492). Therefore, this recombinant flagellin may be further applied for developing melioidosis detection with human serum |
| URI: | https://rsuir-library.rsu.ac.th/handle/123456789/2300 |
| metadata.dc.type: | Other |
| Appears in Collections: | Sci-Research |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| SUMET WAJANAROGANA.pdf | 1.7 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.